犬瘟热病毒南京分离株核蛋白基因的克隆、表达及其小鼠免疫应答

【摘要】根据GenBank 上发表的犬瘟热病毒（CDV）毒株序列设计一对跨越核衣壳（N）蛋白编码区的引物，采用RT-PCR 扩增CDV 南京分离株（CDV-NJ15）N 基因，并将其插入到pMD 18-T 中，构建克隆载体pMD-N。对克隆载体pMD-N 进行双酶切，将得到的CDV-NJ15 N 基因定向克隆到pcDNA3.1(-)真核表达质粒中, 通过磷酸钙介导转染COS-7 细胞，用SDS-PAGE 和Western-blot 分别鉴定表达产物的相对分子量及其免疫原性。结果证明获得正向插入的pcDNA-N 重组表达质粒，表达产物的相对分子量约58.2kD, 与预期值大小一致，且该表达产物能够被CDV-Onderstepoort 株的兔血清识别，表明构建的pcDNA-N 能在哺乳动物细胞中表达并且具有抗原性。以构建好的CDV N 和H 基因重组表达质粒pcDNA-N 和pcDNA-H 为DNA 疫苗，分组免疫5-6 周龄昆明小鼠，以2 周为间隔，共免疫4 次，最后一次免疫3 周后眼眶采血分离血清，酶联免疫吸附试验（ELISA）和病毒中和试验（SN）分析DNA 免疫在小鼠体内诱导的免疫应答。结果显示pcDNA-N和pcDNA-H 单独免疫分别激发了102.69±0.149 和102.63±0.147 滴度的ELISA 抗体，联合免疫激发了102.93±0.165滴度的ELISA 抗体，低于弱毒疫苗产生的抗体滴度（103.35±0.252），两者差异显著（p<0.05）。两种质粒单独或联合免疫分别产生了100.903±0.252、100.963±0.252 和101.204±0.343 的中和抗体，与弱毒疫苗（101.88±0.151）比较差异极显著（p<0.01）。而空质粒pcDNA3.1(-)免疫后未检测到特异性的抗CDV 抗体， 表明表达CDV N和H 基因的重组质粒DNA 免疫小鼠可以诱导产生特异性体液免疫。
【关键词】犬瘟热病毒；N 基因；H 基因；克隆与表达；DNA 免疫

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