7．2  试验容器

7．2．1  对虾仔虾试验用 1000ml 烧杯或其他同等体积的玻璃水槽。

7．2．2   卤虫无节幼体试验用40ml～50ml的烧杯或其他同等体积的玻璃水槽。

7．3  环境因子测定的试剂和仪器

7．3．1    按GB 17378.4 第27、30、32章要求的试剂或仪器。

7．3．2    除  7.3.1要求外，可选用的试剂和仪器包括经校正的普通温度计、精密试纸等。

7．4  其他

        搅拌器、显微镜、胶头滴管、量筒、手抄网等。

 

 

8．1 试验室环境必须干净、无污染，避免人为的影响因素。

8．2 试验人员必须作好安全防护措施，如配备工作服，一次性手套等。

 

 

9．1 试验生物来源、饲养和选择

9．1．1 对虾仔虾

9．1．1．1  来源

         从虾苗厂购入或生物毒性实验室自繁饲养。

9．1．1．2   饲养

         对虾仔虾饲养的适宜条件见表1。购入的仔虾必须在实验室驯养48h后才可用于毒性试验，自繁饲养的仔虾必须在试验开始前24h 从饲养室移入实验室。

 

表1  仔虾试验室饲养条件

9．1．2     卤虫幼体

9．1．2．1  卤虫卵来源  从商场购入或实验室自繁收集。

9．1．2．2   卤虫卵孵化  取1g/L卤虫卵加入稀释水中，在25℃、盐度30～35、光照2 000 Lx~3 000 Lx的环境条件下充氧孵化，取同一批次孵出的无节幼体放入稀释水中经20h～24h饲养后，选择消化道形成后的幼体用于毒性试验。

9．1．3  合格的试验生物

9．1．3．1  健康、正常的试验生物，24h内死亡率小于10%。

9．1．3．2  试验生物的24h标准毒物敏感试验的毒性结果必需与其它批次试验生物的敏感范围一致。

9．2  稀释水的准备

        使用人工海水作为稀释水，盐度30,pH （7.9+0.2）,溶解氧接近饱和。用作稀释水的人工海水配方必须经试验生物饲养试验，证明其对试验生物的生长发育无明显影响或是已经普遍使用的人工海水配方。

9．3  贮备液的配制

9．3．1  泥浆贮备液的配制

9.3.1.1  油基泥浆  按体积比取1份泥浆加入9份稀释水，2000r/min～3000r/min搅拌15h至絮状，然后加水稀释为试验组的最高浓度，继续搅拌5min，静置60min后取上层混悬液作为贮备液。

9．3．2．1  油基泥浆钻屑  取一定重量的钻屑加入稀释水中，2 000 r/min～3 000r/min搅拌15h，取上层混悬液作为贮备液，试验前充分搅拌。贮备液浓度小于100 000mg/L。

9．3．2．2   水基泥浆钻屑贮备液的准备同水基泥浆。

9．3．3  生产水贮备液的配制

        取一定体积的生产水加入稀释水中2 000r/min搅拌15min，配制成预定浓度的贮备液。

9．4  预备试验

9．4．1  选取4组～5组等比或等间距浓度，如1，10，100，1 000mg/L及对照组，设2个～4个重复样，每个容器放5个生物进行试验，以确定全部死亡和存活的浓度范围。温度、pH、溶解氧要求与驯养条件一致，每24h观察记录死亡率，及时取出死亡生物。如试验结果不能确立正式试验液浓度范围则需要重新选择浓度并重复预备试验。

9．4．2  在为判定是否符合某个特定毒性容许值的试验中，预备试验浓度可在大于毒性容许值设置等距浓度。

9．5  正式试验

9．5．1  试验浓度设置

9．5．1．1 在预备试验设定的浓度范围内，设定5个等对数间距或等比浓度组和1个对照组，建议采用的等对数间距为1，1.35， 1.8， 2.4，3.2，4.2，5.6，7.5等及其10的各次方倍数，等比的稀释因子为0.5。如需计算LC50值，试验浓度应包括无死亡和全部死亡的浓度，用以得到至少三个连续的死亡浓度。每个试验浓度至少4个重复样。每个容器包括10个生物体。

9．5．1．2  在为判定是否符合某个特定毒性容许值的试验中，如试验生物预备试验的LC50远大于毒性容许值，则可在大于容许值的区间选择等间距浓度。

9．5．2   试验生物移入

9．5．2．1  对虾仔虾 用手抄网在驯养池中随机选择试验生物并及时放入试验容器内。弃用跃出或损伤的生物。在试验操作过程中，应在30min内完成分放试验生物。

9．5．2．2   卤虫幼体 用胶头滴管在驯养容器随机吸取卤虫幼体，然后小心移入试验容器。应在30min内完成分放试验生物。

9．5．3   试验溶液更新

        每24h准备新的试验溶液，然后从对照组开始，由低浓度到高浓度试验组逐级移入存活的试验生物。

9．5．4  充气要求

        当试验溶液的溶解氧浓度小于60％的饱和度，必须对试验溶液进行轻微充气，充气气泡为60个/min～100个/min。如试验组进行充气，同样对照组也需进行充气。

9．5．5   试验的环境因子

        试验适宜的环境为温度23℃～28℃，盐度28～33, pH7.6~8.2，试验过程中温度变化范围不超过2℃，盐度变化范围不超过2，pH值变化范围不超过0.4。

9．5．6   饲喂

9．5．6．1  对虾仔虾喂卤虫无节幼体 50个/d 。

9．5．6．2  卤虫幼体饲喂扁藻、小球藻等单细胞藻类，藻液离心后饲喂，应避免加入藻液引起试验溶液体积的明显改变。

9．5．7  观察和记录

        每24h观察试验生物两次并记录异常行为，尽快移去试验生物的死亡个体。试验生物存活数记录在原始记录表内，见附录A（标准的附录）。

9．6  环境因子的测定和记录

9．7   试验生物死亡判定

        试验生物体色变成不透明，轻触无反应或在显微镜下观测心脏停止跳动均可判定为死亡。

 

 

10．1  结果的有效性

        试验溶液的溶解氧必须达到60％饱和度以上，对照组的死亡率不超过10％，驯养生物24h的LC50 和同一实验室其它批次同种生物的试验结果相符。

10．2  试验结果的判定

        生物毒性的试验结果判定见附录C标准的附录。

10．2．1   在大于或等于生物毒性容许值的试验浓度组未出现试验生物死亡，直接判定为大于生物毒性容许值。

10．2．2   在小于生物毒性容许值的试验浓度组出现试验生物死亡，对试验结果进行正态分布和方差齐次检验，如符合正态检验和方差齐次检验则采用附录D（提示的附录）的参数检验方法（Dunnett's 检验）判定NOEC值。如不符合正态检验或方差齐次检验则采用附录D（提示的附录）的非参数秩检验方法（Steel's 多对一检验）判定NOEC值，以NOEC值来判定是否符合生物毒性容许值。

10．2．3   当小于生物毒性容许值的试验浓度组出现生物死亡，并且有一组的死亡率为100％时，可通过图表法或概率法计算LC₅₀值。图表法直接判定是否符合生物毒性容许值，概率计算法计算置信区间，以置信上限是否大于毒性容许值为判定限。96h LC₅₀的概率计算法见附录E（提示的附录）。

 

 

11．1   批间和批内质量控制

11．1．1 每批次试验必须同时进行标准毒物的24h生物毒性试验，通过比较LC50值评价试验生物质量的稳定性。

11．1．2 保证试验过程试验环境因子的一致性，即试验期间的温度变化不超过2℃，盐度变化不超过2,

        pH变化范围不超过0.4,溶解氧大于60%的饱和度。

11．2  原始记录

        原始记录应完整。包括：采样和试验的时间、地点、时间；样品的保存方法； 采样和试验人员签名；试验所用的方法和技术；质量控制记录；试验的原始资料，仪器校准和维修记录；试验报告等。

 

 

        检验报告包括检验报告表和试验报告。

12．1  检验报告表

        检验报告表包括：送样单位、送样人、送样时间、样品名称、样品编号、样品接受人、检验依据的标准、试验结果和依据GBXXXXX对试验结果判定的结论、出具检验结果的生物毒性试验室签章等。生物毒性检验报告表的格式见附录B。

12．2  试验报告

        试验报告包括：试验物质的化学性质和其他材料；稀释水，贮备液，和试验溶液的配制；试验动物驯养和负荷数；对照组死亡数和标准物质LC50的生物数据；用浓度反应曲线或方程表示的试验浓度和试验生物反应的关系。